گاهی در فرایند سفارش سنتز پرایمر، لازم است در یک موقعیت نوکلئوتیدی از توالی پرایمر، دو یا چند نوکلئوتید متفاوت به‌صورت هم‌زمان در نظر گرفته شوند. این حالت معمولاً زمانی پیش می‌آید که قصد داریم چند توالی ژنتیکی متفاوت را با استفاده از یک جفت پرایمر بررسی کنیم.
برای مثال، فرض کنید قصد دارید با استفاده از یک جفت پرایمر، تمام ترنسکریپت‌واریانت‌های یک ژن انسانی را بررسی کنید. اگر توالی این واریانت‌ها تنها در یک موقعیت نوکلئوتیدی با یکدیگر تفاوت داشته باشد، ممکن است توالی‌های زیر را مشاهده کنید:
GCTTAGAGGTACCATTG
GCTTAGTGGTACCATTG
GCTTAGCGGTACCATTG
در این مثال، نوکلئوتیدهای A، T و C در یک ناحیه با یکدیگر متفاوت هستند و هدف، بررسی هر سه واریانت با استفاده از یک جفت پرایمر است.
برای این منظور، دو راهکار وجود دارد:
- روش اول: سه پرایمر با توالی‌های متفاوت، به‌صورت جداگانه سنتز شوند و در واکنش PCR مورد استفاده قرار گیرند.
- روش دوم: هر سه حالت نوکلئوتیدی در قالب یک سفارش سنتز پرایمر دژنره در نظر گرفته شوند تا مخلوطی از توالی‌های موردنظر در یک محصول سنتزی تهیه شود.
در روش دوم، برای نمایش موقعیت نوکلئوتیدی متغیر، به نمادی نیاز داریم که به‌صورت اختصاری تمام نوکلئوتیدهای موردنظر را نشان دهد. برای این منظور، از کدهای استانداردی به نام IUPAC Codes استفاده می‌شود.
IUPAC Nucleotide Codes
| نوکلئوتید | کد نوکلئوتیدی | |
| A | آدنین(Adenine) | A |
| C | سیتوزین (Cytosine) | C |
| G | گوانین(Guanine) | G |
| T | تیمین(Thymine) | T |
| U | یوراسیل(Uracil) | U |
| A/G | باز های پورینی | R |
| T/C | بازهای پیریمیدینی | Y |
| G/T | گوانین/تیمین | K |
| A/C | آدنین/سیتوزین | M |
| G/C | گوانین/سیتوزین | S |
| A/T | آدنین/تیمین | W |
| G/T/C | گوانین/تیمین/سیتوزین | B |
| G/A/T | گوانین/آدنین/تیمین | D |
| A/C/T | آدنین/سیتوزین/تیمین | H |
| G/C/A | گوانین/سیتوزین/آدنین | V |
| A/T/C/G | آدنین/تیمین/سیتوزین/گوانین | N |
سوالات متداول کدهای IUPAC و طراحی پرایمر دژنره
۱. کدهای IUPAC در طراحی پرایمر چیستند؟
کدهای IUPAC نمادهای استانداردی هستند که برای نمایش یک یا چند نوکلئوتید ممکن در یک موقعیت از توالی DNA یا RNA استفاده می‌شوند.
۲. کد N در توالی پرایمر به چه معناست؟
کد N نشان‌دهنده هر چهار نوکلئوتید A، C، G و T است و زمانی استفاده می‌شود که هر چهار حالت در یک موقعیت ممکن باشند.
۳. کد H در طراحی پرایمر چه نوکلئوتیدهایی را نشان می‌دهد؟
کد H نشان‌دهنده نوکلئوتیدهای A، C یا T است و گوانین (G) را شامل نمی‌شود.
۴. پرایمر دژنره (Degenerate Primer) چیست؟
پرایمر دژنره پرایمری است که در یک یا چند موقعیت آن از کدهای IUPAC استفاده می‌شود تا چند توالی نوکلئوتیدی متفاوت را پوشش دهد.
۵. تفاوت پرایمر معمولی با پرایمر دژنره چیست؟
پرایمر معمولی در هر موقعیت توالی مشخصی دارد؛ اما پرایمر دژنره می‌تواند در یک یا چند موقعیت، چند نوکلئوتید ممکن را شامل شود.
۶. کدهای IUPAC چه کاربردی در PCR دارند؟
این کدها امکان طراحی پرایمرهایی را فراهم می‌کنند که بتوانند چند توالی هدف مشابه اما غیریکسان را پوشش دهند.
۷. آیا می‌توان چند پرایمر را با یک سفارش سنتز تهیه کرد؟
بله. در صورت پشتیبانی شرکت سنتزکننده، می‌توان یک توالی دژنره سفارش داد تا مخلوطی از توالی‌های دارای نوکلئوتیدهای مشخص‌شده تهیه شود.
۸. آیا پرایمر دژنره می‌تواند چند واریانت ژنی را شناسایی کند؟
بله، به شرط آنکه طراحی پرایمر با توالی واریانت‌ها سازگار باشد. عملکرد پرایمر برای هر واریانت باید بررسی شود.
۹. آیا استفاده از کدهای IUPAC در انتهای 3′ پرایمر مناسب است؟
این کار به بررسی دقیق نیاز دارد؛ زیرا تغییر نوکلئوتید در انتهای 3′ می‌تواند بر اتصال پرایمر و عملکرد DNA پلیمراز تأثیر بگذارد.
۱۰. چگونه کدهای IUPAC مناسب را برای سفارش سنتز پرایمر انتخاب کنیم؟
ابتدا نوکلئوتیدهای ممکن در هر موقعیت مشخص می‌شوند؛ سپس کد متناظر از جدول IUPAC انتخاب و سازگاری توالی با روش سنتز شرکت بررسی می‌شود.
[…] کدهای IUPAC در طراحی و سفارش سنتز پرایمر؛ نوکلئوتیدهای دژ… […]