چرا miRNA به طور مستقیم در Real-Time PCR قابل بررسی نیست؟
میکرو RNAها (miRNA) گروهی از RNAهای کوچک تنظیمکننده بیان ژن هستند که معمولاً طولی در حدود 18 تا 25 نوکلئوتید دارند. حداقل سایز قطعه جهت PCR، 80bp است که این طول کوتاه باعث میشود امکان طراحی یک جفت پرایمر استاندارد برای تکثیر مستقیم آنها در واکنش Real-Time PCR وجود نداشته باشد.
برای غلبه بر این محدودیت، از روش Polyadenylation استفاده میشود. در این روش، آنزیم Poly(A) Polymerase تعدادی باز آدنین را به انتهای 3′ مولکول miRNA اضافه میکند و پس از آن در مرحله سنتز cDNA، با اتصال پرایمر آداپتور به دم پلی A، طول قطعه افزایش یافته و برای PCR مناسب میشود.
Poly(A) Polymerase چگونه عمل میکند؟
آنزیم Poly(A) Polymerase با استفاده از ATP، نوکلئوتیدهای آدنین را به انتهای 3′ رشته RNA اضافه میکند. محصول این واکنش، RNA دارای Poly(A) Tail است که امکان اتصال پرایمرهای اختصاصی در مراحل بعدی را فراهم میکند.
در سلولهای یوکاریوتی، این فرایند به طور طبیعی در طی بلوغ mRNA رخ میدهد و نقش مهمی در پایداری، انتقال و ترجمه RNA دارد. در کاربردهای تحقیقاتی، همین ویژگی برای افزایش طول RNAهای کوتاه مانند miRNA مورد استفاده قرار میگیرد.
نقش Polyadenylation در سنتز cDNA
پس از افزودن دم Poly(A)، در مرحله سنتز cDNA از یک RT Adaptor Primer استفاده میشود. این پرایمر دارای دو بخش است:
- بخش Poly(T) برای اتصال به دم Poly(A) اضافه شده به microRNA
- بخش Adapter Sequence برای اتصال پرایمر Reverse در واکنش Real-Time PCR
در نتیجه، طول مولکول افزایش یافته و شرایط لازم برای طراحی یک جفت پرایمر و تکثیر اختصاصی miRNA فراهم میشود.
مزایای استفاده از Poly(A) Polymerase در مطالعات miRNA
- امکان بررسی طیف گستردهای از miRNAها با یک مرحله سنتز cDNA
- افزایش انعطافپذیری در طراحی پرایمر
- مناسب برای سنتز cDNA از RNAهای کوتاه
- سازگار با روشهای متداول Real-Time PCR
- قابل استفاده در مطالعات بیان ژن و بیومارکرهای مولکولی
کاربردهای تحقیقاتی Poly(A) Polymerase
این آنزیم در بسیاری از پروژههای زیستشناسی مولکولی مورد استفاده قرار میگیرد، از جمله:
- بررسی الگوی بیان miRNA
- مطالعات سرطان و بیومارکرهای مولکولی
- تحقیقات ژنتیک و اپیژنتیک
- مطالعات تنظیم بیان ژن
- آمادهسازی نمونه برای سنتز cDNA
کیت Technogene Poly(A) Polymerase
کیت Technogene Poly(A) Polymerase با هدف تأمین نیاز مراکز تحقیقاتی و آزمایشگاههای زیستمولکولی طراحی و تولید شده است. این محصول با بهرهگیری از فرایندهای کنترل کیفیت و تحقیق و توسعه تخصصی، فعالیت و پایداری بالایی را در واکنش Polyadenylation فراهم میکند و برای کاربردهای تحقیقاتی مرتبط با miRNA و سنتز cDNA مناسب است.
برای مشاهده مشخصات فنی، پروتکل و شرایط نگهداری محصول، به صفحه محصول مراجعه کنید.
نظرات کاربران