کروماتوگرافی و انواع آن

کروماتوگرافی، تکنیک حساس جداسازی ترکیبات دارای خواص شیمیایی نزدیک به هم، بر اساس خواص فیزیکی آنها از یکدیگر است. در گذشته این تکنیک جهت جداسازی رنگ ها (chrom) از یکدیگر استفاده می‌شده است به همین دلیل Chromatography نام گذاری شده است. اما امروزه جهت جستجو، جداسازی و تخلیص، تعیین مقدار ترکیبات مختلف گاز ها، یونهای معدنی، اسیدهای آمینه، قندها، لیپیدها، ویتامین ها، داروها، ترکیبات استروئیدی، اسیدهای نوکلئیک، پروتئین، پلی ساکارید و… مورد استفاده قرار می‌گیرد.

اساس کروماتوگرافی

میزان و تفاوت تمایل ترکیبات، به دو فاز ثابت (Stationary) و متحرک (Mobile) موجب جداسازی ترکیبات از یکدیگر می‌شود. معمولا این ترکیبات در یک حلال (فاز متحرک) حل شده و از روی فاز ثابت جریان پیدا می‌کند و هر چه میزان تمایل ماده به فاز ثابت بیشتر باشد، سرعت حرکت آن کاهش یافته و از ترکیب دارای تمایل کمتر جدا می‌شود.

بر اساس ماهیت فازهای ثابت (جامد یا مایع) و متحرک (مایع یا گاز)، کروماتوگرافی به 4 گروه جامد-مایع، مایع-مایع، جامد-گاز و مایع-گاز تقسیم می‌شود.

کروماتوگرافی جامد-مایع

به طور کلی این تکنیک، کروماتوگرافی ستونی است که در آن مواد جامد متفذ دار متخلخل در ستون قرار گرفته و حلال از بین ماتریکس عبور کرده و بر اساس اندازه، بار و تمایل به لیگاند با سرعت متفاوت حرکت می‌کنند.

Size-exclusion chromatography

در این مدل جداسازی، مولکول ها از بین دانه های منفذدار عبور می‌کنند. ذرات کوچکتر به علت ورود به منافذ، دیرتر از ستون عبور کرده و سرعت کمتری داشته اما ذرات بزرگتر به علت اینکه کمتر وارد منافذ می‌شوند، سریعتر در ستون حرکت کرده و عبور می‌کنند.

کروماتوگرافی تعویض یونی (Ion exchange chromatography)

در این تکنیک پایه رزینی با گروه های عاملی متصل شونده وجود دارد که این گروه های عاملی از یک طرف به صورت کووالان به ذره رزین پایه متصل شده و از طرف دیگر با پیوند های سست الکترواستاتیک، به یونهای دارای بار مخالف متصل می‌شوند. از آنجایی که این یون ها می‌توانند توسط یون های موجود در محلول تعویض شوند، با این اسم نامگذاری شده است. بر اساس گروه عاملی رزین، دو نوع کروماتوگرافی تعویض یونی آنیونی و کاتیونی وجود دارد

رزین تعویض آنیونی

در این روش، رزین دارای گروه عاملی با بار مثبت مثل دی اتیل آمین یا دی اتیل آمینواتیل(DEAE) است که با گروه های آنیونی مثل هیدروکسیل(^–OH) فاز مایع جاذبه برگشت پذیر الکترواستاتیک ایجاد می‌کنند. این آنیون می‌تواند با آنیون ^–Cl موجود در نمونه جایگزین شود.

رزین تعویض کاتیونی

در رزین، گروه های عاملی با بار منفی نظیر گروه اسیدی قوی سولفونات یا گروه اسیدی ضعیف کربوکسیلات، کربوکسی متیل، فسفات، سولفومتیل، سولفوپروپیل یا سولفواتیل با کاتیون های موجود در فاز مایع مثل ⁺H پیوند الکترواستاتیک داشته و این کاتیون میتواند با یون ⁺Na موجود در نمونه جایگزین شود.

کروماتوگرافی تمایلی ( افینیتی کروماتوگرافی)

در این روش، در فاز جامد، یک ماده با قابلیت اتصال اختصاصی مثل آنتی بادی وجود دارد که به صورت خاص به مولکول یا ماده مورد نظر متصل شده و با شستشو سایر اجزای متصل نشده، از آنها جدا می‌شود.

ستون تخلیص Ni-NTA

Ni-NTA chromatography یکی از پرکاربردترین روش‌های خالص‌سازی پروتئین‌های نوترکیب است که اساس آن کروماتوگرافی تمایلی (Affinity Chromatography) می‌باشد. در این روش، از یک رزین پوشیده شده با گروه NTA (Nitrilotriacetic Acid) استفاده می‌شود که به یون های Ni متصل است. اسید آمینه هیستیدین تمایل بالایی به اتصال به یون نیکل دارد. در نتیجه از این روش برای جداسازی پروتئین های نوترکیبی که به انتهای آنها دم پلی هیستیدین ( His tag) اضافه شده است استفاده می‌شود.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا(HPLC)

این روش مدل تکامل یافته روش ستونی است; در مدل های ستونی پیشین، عبور نمونه از ستون، با استفاه از فشار هیدرواستاتیک معمولی یا نیروی جاذبه، صورت می گیرد . در نمونه های حساس، اتلاف زمان موجب تخریب آنها می‌شود، یا برای جداسازی قطعات با شباهت بیشتر به یکدیگر، هر چه تراکم ستون بیشتر شود، این جداسازی بهتر اتفاق می‌افتد. اما افزایش تراکم موجب حرکت بسیار آهسته نمونه از ستون می‌شود. به منظور برطرف کردن این مشکل، در HPLC، نمونه توسط پمپ با فشار به داخل ستون تزریق می‌شود و فرایند عبور سریعتر انجام می‌شود.

کروماتوگرافی مایع-مایع

در این تکنیک جداسازی بر اساس تفاوت در حلالیت اجزا در دو حلال آلی غیر قطبی و حلال آبی قطبی از یکدیگر جدا می‌شوند. اگر حلال ثابت قطبی تر از حلال متحرک باشد سیستم از نوع فاز طبیعی ( Normal phase) و اگر حلال متحرک قطبی تر باشد، فاز معکوس (Reverse Phase) گفته می‌شود. از آنجایی که ترکیبات یونی عموما در آب محلول هستند، این نوع کروماتوگرافی برای ترکیبات غیر یونی مناسبتر است. از آنجایی که وجود یک چارچوب یا بستر جامد، انجام آزمایش را تسهیل می‌بخشد، امروزه در این روش از فاز ثابت مایع کاذب استفاده می‌شود که به پلیمر های دارای وزن مولکولی بالا نامحلول در فاز متحرک متصل شده است. این پلیمر در اتصال یا حرکت اجزا اثری نداشته و صرفا به عنوان یک بستر عمل می‌کند.

کروماتوگرافی صفحه ای

نوعی کروماتوگرافی مایع-مایع است که در آن از دو نوع صفحه جاذب فاز ثابت استفاده می‌شود. در کروماتوگرافی کاغذی(Paper chromatography)، فاز ثابت لایه ای از آب و یا یک حلال قطبی است که فیبر های کاغذ را پوشانده است. در کروماتوگرافی لایه نازک (Thin layer chromatography, TLC) از ماده نازک جاذب از جنس سیلیکا ژل، سلولز یا دکستران با اتصالات عرضی استفاده می‌شود که به طور یکنواخت بر روی یک صفحه شیشه ای یا پلاستیکی پخش شده است. این روش برای جداسازی اسیدهای آمینه و مونوساکارید کاربرد بیشتری دارد.

کروماتوگرافی (GC)

این روش جهت جداسازی ترکیبات فرار یا قابلیت تبدیل به ترکیبات فرار استفاده می‌شود. که به دو صورت کرماتوگرافی گاز-جامد (GSC) با فاز ثابت جامد یا کروماتوگرافی گاز-مایع(GLC) با فاز ثابت مایع غیرفرار انجام می‌شود. ترکیبات فراری که بیشتر در فاز گازی می‌مانندف ضریب تقسیم پایینی داشته و سریعا از ستون عبور می‌کنند اما ترکیبات با نقاط جوش بالا، آهسته تر از ستون خارج می‌شوند.

خلاصه

کروماتوگرافی یکی از مهم‌ترین تکنیک‌های جداسازی و آنالیز مواد است که بر اساس تفاوت برهم‌کنش ترکیبات با فاز ثابت و فاز متحرک، اجزای یک مخلوط را از یکدیگر جدا می‌کند. این تکنیک با توجه به نوع فاز و مکانیسم جداسازی، روش‌های متنوعی دارد. در کروماتوگرافی رد- اندازه ای(Size-Exclusion)، مولکول‌ها بر اساس اندازه از یکدیگر تفکیک می‌شوند؛ در کروماتوگرافی تعویض یونی، تفاوت بار الکتریکی عامل اصلی جداسازی است؛ و در کروماتوگرافی تمایلی (Affinity)، اتصال اختصاصی مولکول هدف به یک لیگاند برای خالص‌سازی استفاده می‌شود. Ni-NTA نیز یکی از انواع کروماتوگرافی تمایلی است که به‌طور گسترده برای تخلیص پروتئین‌های دارای His-tag به کار می‌رود. HPLC با استفاده از فشار بالا، جداسازی دقیق و کارآمد ترکیبات را در ستون‌های تخصصی امکان‌پذیر می‌کند. در کروماتوگرافی مایع-مایع، تفاوت توزیع ترکیبات میان دو فاز مایع اساس جداسازی است، در حالی که کروماتوگرافی کاغذی و TLC از روش‌های ساده‌تر برای جداسازی و بررسی ترکیبات هستند. در نهایت، کروماتوگرافی گازی (GC) برای جداسازی و آنالیز ترکیبات فرار یا قابل فرار شدن استفاده می‌شود. هر یک از این روش‌ها بر اساس ویژگی‌های نمونه و هدف آزمایش، کاربرد خاصی در شناسایی، جداسازی، اندازه‌گیری و تخلیص مواد دارند.