نقش بافر TBE در الکتروفورز ژل آگارز
بافر TBE (Tris-Borate-EDTA) یکی از رایجترین محلولهای مورد استفاده در تکنیک الکتروفورز ژل آگارز است که برای جداسازی قطعات DNA و RNA بر اساس اندازه به کار میرود.
این بافر با ایجاد یک محیط پایدار یونی و حفظ شرایط مناسب pH، امکان مهاجرت یکنواخت اسیدهای نوکلئیک در میدان الکتریکی را فراهم میکند.
اجزای تشکیلدهنده بافر TBE و عملکرد آنها
Tris Base
Tris نقش اصلی در حفظ pH محیط الکتروفورز را بر عهده دارد. این ترکیب باعث میشود pH در محدوده مناسب (حدود 8 تا 8.3) ثابت بماند و در نتیجه بار منفی مولکولهای DNA و RNA در طول فرآیند مهاجرت حفظ شود.
این پایداری pH برای جلوگیری از تغییر رفتار الکتروفورزی قطعات بسیار مهم است.
نکته مهم: استفاده Tris HCl مناسب این بافر نبوده و به علت pH اسیدی آن، در کنار بوریک اسید، اسیدیته محلول بالا رفته و الکتروفورز با اختلال مواجه میشود
Borate (بوریک اسید)
بورات به عنوان جزء بافری مکمل در کنار Tris عمل کرده و به تثبیت شرایط یونی کمک میکند. حضور این ترکیب باعث افزایش پایداری سیستم بافری در جریان ولتاژهای بالای الکتروفورز میشود.
EDTA
EDTA یک عامل شلاتهکننده یونهای دوظرفیتی مانند Mg²⁺ و Ca²⁺ است. این یونها برای فعالیت بسیاری از نوکلئازها ضروری هستند، بنابراین حذف آنها باعث کاهش فعالیت آنزیمهای تخریبکننده DNA و RNA در طول فرآیند میشود.
به همین دلیل EDTA نقش محافظتی در حفظ یکپارچگی اسیدهای نوکلئیک دارد.
آمادهسازی بافر TBE (استوک 10X)
برای تهیه محلول ذخیره 10X، ترکیبات زیر استفاده میشود:
- Tris base: 0.89 M
- Boric acid: 0.89 M
- EDTA: 20 mM
این ترکیب به عنوان محلول مادر نگهداری شده و در هنگام مصرف رقیق میشود.
تهیه محلول کاری 1X
برای استفاده در الکتروفورز ژل آگارز، محلول 10X باید به نسبت 1 به 9 با آب مقطر رقیق شود.
در نتیجه غلظت نهایی به صورت زیر خواهد بود:
- Tris: 89 mM
- Borate: 89 mM
- EDTA: 2 mM
نکات مهم در تهیه TBE
- EDTA معمولاً حلشوندگی کمتری نسبت به سایر اجزا دارد و بهتر است ابتدا به صورت جداگانه در حضور NaOH حل و سپس pH آن تنظیم شود.
- پس از تهیه محلول، pH نهایی باید در محدوده 8 تا 8.3 تنظیم گردد.
- در برخی روشها امکان ترکیب خشک مواد و سپس رساندن به حجم نهایی وجود دارد، اما حل شدن EDTA ممکن است زمانبر باشد.
- رعایت ترتیب حل شدن مواد میتواند از تشکیل رسوب جلوگیری کند.
کاربردهای بافر TBE در آزمایشگاه
- الکتروفورز DNA در ژل آگارز
- بررسی کیفیت و اندازه RNA
- آمادهسازی نمونه برای کلونینگ و آنالیز ژنتیکی
- استفاده در روشهای استاندارد زیستشناسی مولکولی
ابزار محاسبه آمادهسازی بافر
برای سهولت در تهیه محلولهای 1X، 5X و 10X میتوان از ابزارهای محاسبه غلظت استفاده کرد که حجم مورد نیاز هر جزء را بر اساس فرمول رقیقسازی (C₁V₁ = C₂V₂) مشخص میکنند.
محلول TBE 10X برند Technogene
نظرات کاربران