Poly (A) Polymerase

معرفی آنزیم Poly(A) Polymerase و کاربرد کیت بومی‌سازی‌شده شرکت راتین ژن

آنزیم Poly(A) Polymerase نقش حیاتی در فرآیند پلی‌آدنیلاسیون RNA ایفا می‌کند. این آنزیم با استفاده از ATP، زنجیره‌ای از نوکلئوتیدهای آدنین (A) را به انتهای 3′ RNA اضافه می‌نماید؛ فرآیندی که برای پایداری، ترجمه مؤثر و تنظیم microRNA‌ها ضروری است.

شرکت راتین ژن برای نخستین‌بار در کشور موفق به تولید کیت اختصاصی این آنزیم با کارایی و دوام بالا شده است. در این مطلب، با نحوه استفاده از این کیت، بررسی بیان microRNA، روش‌های غیرفعالسازی آنزیم، نکات کلیدی و راهکارهایی برای رفع خطاهای احتمالی آشنا خواهید شد.

موارد کاربرد کیت Poly(A) Polymerase

• تحلیل بیان microRNA

  • افزودن زنجیره A به انتهای RNA جهت اتصال پرایمر در سنتز cDNA

  • افزایش پایداری RNAها برای استفاده در آنالیزهای مولکولی

• ساخت کتابخانه‌های cDNA

  ارتقای فرآیند توالی‌یابی و کلون‌سازی RNA

• پژوهش‌های ژنتیکی و مولکولی

  • بررسی مسیرهای تنظیمی وابسته به mRNA و microRNA

• کاربردهای درمانی و پزشکی

  • دستکاری RNA برای استفاده در درمان‌های هدفمند

مراحل استفاده از کیت

مواد مورد نیاز:

• RNA با کیفیت بالا

• آنزیم Poly(A) Polymerase

• بافر واکنش

• ATP (سوبسترا)

• آب فاقد RNase

دستورالعمل انجام آزمایش:

1. آماده‌سازی RNA:
   RNA را استخراج و با دستگاه نانودراپ خلوص آن را بررسی نمایید.

2. تهیه مخلوط واکنش:
   ترکیبات زیر را در میکروتیوب RNase-Free ترکیب کنید:

   • 0.5 تا 15 میکروگرم RNA

   • 1 میکرولیتر آنزیم

   • 2 میکرولیتر بافر (10x)

   • 2 میکرولیتر ATP (10 میلی‌مولار)

   • RNase-Free Water به میزان لازم برای تکمیل حجم نهایی

3. انکوباسیون:
   مخلوط را در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 تا 60 دقیقه انکوبه نمایید.

4. پایان واکنش و حذف آنزیم:

   • غیرفعالسازی حرارتی: حرارت دادن در 65 تا 70 درجه به مدت 10 تا 15 دقیقه(به علت تخریب RNA، توصیه نمیشود)

   • غیرفعالسازی شیمیایی: افزودن EDTA تا غلظت نهایی 10 میلی‌مولار

5. تخلیص RNA:
   از روش‌های معمولی مانند استخراج با کیت‌های RNA یا فنل/کلروفرم (TRIzol) استفاده کنید.

بررسی بیان microRNA با استفاده از کیت

• اتصال دم Poly(A) به microRNA

• سنتز cDNA با پرایمر اختصاصی حاوی توالی T

• اجرای qPCR برای بررسی دقیق بیان ژن

خطاهای متداول و راهکارهای پیشنهادی (Troubleshooting)

نکات حیاتی در استفاده از کیت

• RNA و نمونه‌های polyadenylated را در دمای 80- درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید.

• تنها از آب RNase-Free استفاده نمایید. برای تهیه آن، DEPC را به نسبت 1:1000 به آب اضافه کرده، مخلوط را 2 الی 12 ساعت در دمای 37 درجه نگه داشته و سپس اتوکلاو نمایید.

جمع‌بندی

کیت Poly(A) Polymerase شرکت راتین ژن، ابزاری پیشرفته برای تحقیقات مولکولی و بررسی دقیق microRNA است. با بهره‌گیری از این محصول ایرانی و رعایت اصول عملکرد صحیح، می‌توان به داده‌های مطمئن و نتایج علمی ارزشمندی در مطالعات RNA دست یافت.