راهنمای کامل برای سنتز cDNA در آنالیز بیان ژن
مقدمه
سنتز cDNA یکی از مراحل اساسی در مطالعات مولکولی به‌ویژه در تکنیک Real-Time PCR محسوب می‌شود. در این فرآیند، RNA استخراج‌شده با کمک آنزیم ترانسکریپتاز معکوس (RT) به cDNA تبدیل می‌شود. دقت در انتخاب نوع آنزیم، پرایمر و تنظیم صحیح شرایط واکنش، بر کیفیت و صحت نتایج تأثیر مستقیم دارد. در این مقاله، با انواع آنزیم‌های RT، انواع پرایمرها، پروتکل اجرایی و توصیه‌های تخصصی جهت رفع مشکلات رایج آشنا خواهید شد.
انتخاب آنزیم ترانسکریپتاز معکوس
گزینه‌های رایج:
1. آنزیم M-MLV RT
این آنزیم، با دمای فعالیت بین ۴۲ تا ۵۰ درجه سانتی‌گراد، برای سنتز قطعات بلند cDNA مناسب بوده و به مهارکننده‌های موجود در RNA کمتر حساس است.
2. نسخه‌های مهندسی‌شده M-MLV
با اصلاح ژنتیکی این آنزیم، فعالیت RNAse H به حداقل رسیده و دمای عملکردی آن تا حدود ۵۵ درجه افزایش یافته است. این ویژگی امکان سنتز cDNA از RNAهای دارای ساختارهای پیچیده ثانویه را نیز فراهم می‌سازد.
3. آنزیم فوق مهندسی شده:
آنزیم HyperTherm SynFusion Reverse Transcriptase با افزودن توالی هایی به دو سر N,Cترمینال آنزیم و ایجاد Point mutation در توالی آنزیم M-MuLV موجب افزایش پایداری دمایی تا 65 درجه سانتی گراد و افزایش فعالیت آنزیم شد و با ایجاد جهش در دومن RNase H فعالیت آن را به حداقل رسانده تا بازدهی سنتز قطعات بلند به میزان قابل توجهی بالا برود.
انتخاب پرایمر مناسب
انتخاب نوع پرایمر، بازدهی و دقت سنتز cDNA را تعیین می‌کند. گزینه‌های پرکاربرد عبارتند از:
Oligo(dT): اتصال به دم Poly-A انتهای mRNA؛ مناسب برای سنتز از RNA پیام‌رسان.
Random Hexamer: پرایمرهای تصادفی ۶ نوکلئوتیدی؛ مناسب برای سنتز از کل RNA، مخصوصاً RNA ویروسی.
Gene-specific primers (GSPs): پرایمرهای طراحی‌شده برای توالی خاصی از یک ژن هدف؛ برای بررسی هدفمند یک ترنسکریپت.
پرایمرهای ویژه microRNA:
روش اول: استفاده از پرایمرهای حلقوی اختصاصی برای هر microRNA
روش دوم: افزودن دم Poly-A به microRNA با استفاده از آنزیم Poly(A) Polymerase و سنتز عمومی cDNA با پرایمر حاوی توالی T و backbone
پروتکل استاندارد سنتز cDNA
مرحله ۱: آماده‌سازی RNA و حذف DNA ژنومی
خلوص RNA را با نسبت A260/A280 (بین ۱.۸ تا ۲) در نانودراپ بررسی کنید.
RNA را روی ژل ۱٪ آگارز بارگذاری کرده و از سالم بودن آن مطمئن شوید.
در صورت مشاهده DNA ژنومی:
مثال واکنش حذف DNA با DNase I (حجم نهایی: 10 میکرولیتر):
8RNA میکرولیتر (100–1000 ng)
1DNase I میکرولیتر
1DNase Buffer میکرولیتر
انکوباسیون در 37°C به مدت 10 دقیقه
غیرفعالسازی در 72°C به مدت 10 دقیقه
مرحله ۲: سنتز cDNA
ترکیبات واکنش (برای 20 میکرولیتر نهایی):
RNA: 100–1000 ng
RT Buffer (5X): 4 میکرولیتر
1Reverse Transcriptase میکرولیتر
2dNTPs (40 mM) میکرولیتر
پرایمر مناسب: 1 میکرولیتر
آب بدون نوکلئاز: تا حجم نهایی
برنامه انکوباسیون:
در صورت استفاده از پرایمرهای Random یا GSP، انکوباسیون اولیه در 25°C به مدت 10 دقیقه
واکنش اصلی: 45–65°C به مدت 30–60 دقیقه (بسته به آنزیم)
توقف آنزیم: 85°C به مدت 5 دقیقه
نگهداری: روی یخ یا در دمای 20- درجه
نکات کلیدی برای موفقیت بیشتر
RNA عاری از DNA ژنومی استفاده کنید. برای حفاظت RNA از تخریب، از RNase Inhibitor بهره بگیرید. در صورت وجود ساختارهای پیچیده در RNA، آنزیم مقاوم به حرارت انتخاب شود. نوع پرایمر متناسب با هدف آزمایش تعیین شود.
مشکلات رایج و راهکارها
| مشکل | علت احتمالی | راه‌حل پیشنهادی |
|---|---|---|
| بازده پایین | کیفیت پایین RNA | استفاده از RNase Inhibitor |
| DNA باقی‌مانده | حذف ناقص DNA | استفاده از DNase، طراحی پرایمر روی ناحیه exon-exon |
| سیگنال ضعیف در qPCR | مقدار کم cDNA یا RNA، وجود مهار کننده آنزیمی | افزایش RNA ورودی، بررسی کیفیت cDNA، استخراج RNA خالص |
نتیجه‌گیری
سنتز cDNA مرحله‌ای حساس و تعیین‌کننده در تحلیل بیان ژن‌ها است. پیروی از یک پروتکل دقیق، انتخاب درست آنزیم و پرایمر و توجه به خلوص نمونه RNA، همگی در موفقیت این مرحله نقش کلیدی ایفا می‌کنند. رعایت نکات تخصصی ذکرشده می‌تواند بازدهی و دقت نتایج qPCR را به شکل چشمگیری افزایش دهد.
نیاز به راهنمایی بیشتر دارید؟
تیم فنی ما آماده ارائه مشاوره تخصصی، طراحی پرایمر و تأمین آنزیم‌های مورد نیاز برای سنتز cDNA است. برای دریافت مشاوره رایگان یا سفارش محصولات، با ما در تماس باشید.
نظرات کاربران